Redundancia y papel del número de copias de proteínas en la maquinaria de polarización celular de la levadura en ciernes

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 6504 (2023) Citar este artículo

Detalles de métricas

¿Cómo puede evolucionar una función celular autoorganizada, adaptarse a las perturbaciones y adquirir nuevas subfunciones? Para avanzar en la respuesta a estas cuestiones básicas de la biología celular evolutiva, analizamos, como ejemplo concreto, la maquinaria de polaridad celular de Saccharomyces cerevisiae. Este módulo celular exhibe una capacidad de recuperación intrigante: permanece operativo bajo perturbaciones genéticas y se recupera de manera rápida y reproducible de la eliminación de uno de sus componentes clave. Utilizando una combinación de modelado, teoría conceptual y experimentos, proponemos que múltiples mecanismos de autoorganización redundantes coexisten dentro de la red de proteínas que subyace a la polarización celular y son responsables de la resiliencia y adaptabilidad del módulo. Con base en nuestra comprensión mecanicista del establecimiento de la polaridad, planteamos la hipótesis de que las proteínas de andamio, al introducir nuevas conexiones en la red existente, pueden aumentar la redundancia de los mecanismos y, por lo tanto, aumentar la capacidad de evolución de otros componentes de la red. Además, nuestro trabajo ofrece una perspectiva de cómo un módulo celular complejo y redundante podría haber evolucionado a partir de una forma ancestral más rudimental.

Los sistemas biológicos están autoorganizados. Su función surge de la interacción colectiva de muchos componentes, regidos por procesos físicos y químicos. ¿Cómo evolucionan y se adaptan estas funciones colectivas (autoorganizadas) a fuertes perturbaciones como la pérdida de componentes esenciales1,2?

Un ejemplo sorprendente de tal adaptación es la maquinaria de polarización celular Cdc42 de S. cerevisiae (levadura en ciernes). La polarización celular dirige la división celular de la levadura en ciernes mediante la formación de una zona polar con una alta concentración de Cdc42 en la membrana (ver Fig. 1a-c). Tras la eliminación de Bem1, un actor clave en la red de interacción Cdc42 (Fig. 1d), las células recuperan su capacidad de polarizarse y dividirse mediante la pérdida de otro componente de esta red. Esto sucede de forma rápida (en un plazo de 100 generaciones) y reproducible3. No está claro cómo funciona esta recuperación.

a A partir de una distribución inicialmente homogénea de Cdc42, se forma una zona polar, marcada por una alta concentración de Cdc42 activo en la membrana plasmática. Hay dos vías de transporte dirigido en las células: b Flujo difusivo citosólico impulsado por un gradiente de concentración sostenido por zonas de unión (flecha roja) y desprendimiento (flecha azul) espacialmente separadas; c El transporte de vesículas (reciclaje endocítico) se dirige a lo largo de cables de actina de orientación polar. El Cdc42 activo dirige tanto la difusión citosólica (mediante el reclutamiento de efectores posteriores que a su vez reclutan Cdc42) como el transporte de vesículas (mediante el reclutamiento de Bni1 que inicia la polimerización de actina). d Red de interacción molecular alrededor de la GTPasa Cdc42, que involucra reguladores de actividad (GEF, GAP) y la proteína de andamio Bem1 (algunos componentes se muestran varias veces para mayor claridad visual, no para implicar un orden cronológico). Un término de reclutamiento efectivo explica el reclutamiento de Cdc42 en la membrana dirigido por Cdc42-GTP facilitado por los socios de interacción de Cdc42, por ejemplo Cla413,31,73 y Rsr186 (e). Los detalles del modelo y la implementación matemática se describen en los Métodos y en la Nota complementaria 1. Para simplificar, no tenemos en cuenta explícitamente los complejos efectores Cdc42. Una extensión del modelo que tuviera en cuenta esos complejos no cambió significativamente los resultados.

La polarización celular de la levadura en ciernes está organizada mediante una compleja red de interacción (Fig. 1d) alrededor de la proteína de polaridad central Cdc42. Cdc42 es una GTPasa que alterna entre un estado activo (unido a GTP) y uno inactivo (unido a PIB). Las características clave de estos dos estados son que el Cdc42 activo está fuertemente unido a la membrana y recluta muchos factores posteriores, mientras que el Cdc42-GDP inactivo puede desprenderse de la membrana al citosol, donde se difunde libremente.

En las células de tipo salvaje (WT), la polarización está dirigida por señales ascendentes como la antigua cicatriz de yema4,5,6,7. Sin embargo, es importante destacar que Cdc42 puede polarizarse espontáneamente en una dirección aleatoria en ausencia de tales señales8,9,10. ¿Cuáles son los procesos elementales que subyacen a la polarización espontánea de Cdc42? En la escala de tiempo del establecimiento de la polaridad, el número total de copias de proteínas Cdc42 (así como sus compañeros de interacción) es casi constante. Por lo tanto, para establecer un patrón espacial en la concentración de proteínas, la llamada zona polar, las proteínas necesitan redistribuirse espacialmente en la célula mediante transporte dirigido. Hay dos vías distintas, en su mayoría independientes, para el transporte dirigido que han sido establecidas mediante estudios experimentales y teóricos9,10,11,12,13: el flujo difusivo citosólico impulsado por un gradiente de concentración sostenido (ley de Fick) y el transporte activo basado en vesículas a lo largo de cables de actina polarizados (Fig. 1b, c).

Una vez que se ha establecido una zona polar, el gradiente de concentración resultante en la membrana conduce a un flujo difuso de proteínas fuera de la zona polar. Para mantener la zona polar, este flujo en la membrana debe contrarrestarse continuamente (re) reciclando las proteínas de regreso a la zona polar a través de un flujo desde el citosol a la membrana10,12,14 o mediante transporte basado en vesículas9,11. En las células WT, Cdc42-GTP recluta Bem1 del citosol, que a su vez recluta el GEF (factor de intercambio de nucleótidos de guanina) Cdc24 (ver Fig. 1d) 8,15. El complejo Bem1-Cdc24 unido a la membrana recluta más Cdc42-GDP del citosol y lo activa (intercambio de nucleótidos)16. El elemento distintivo y crucial de este mecanismo de reclutamiento mutuo es la co-localización de Cdc42 y su GEF Cdc2410,13,16,17,18.

La eliminación de Bem1 interrumpe el reclutamiento y la activación localizados de Cdc4213,18 y, por lo tanto, impide gravemente la capacidad de las células para polarizarse y brotar8,19. Las células Bem1Δ pueden ser rescatadas mediante fragmentos de Bem1 que no pueden mediar en el reclutamiento mutuo de Cdc42 y su GEF Cdc24, sino que solo confieren una mayor actividad global (homogénea) del GEF al aliviar la autoinhibición de Cdc2420,21,22,23. Aún más intrigante, en la evolución experimental, los mutantes bem1Δ son rescatados de manera reproducible por la pérdida posterior de Bem33, uno de los cuatro Cdc42-GAP conocidos que catalizan la hidrólisis de GTP, es decir, cambian Cdc42 a su estado inactivo unido al PIB. Estos hallazgos experimentales sugieren que existe un mecanismo oculto de polarización de Cdc42 que es independiente de la colocalización del GEF y se activa ya sea por una mayor actividad del GEF o por la pérdida de un Cdc42-GAP.

Aquí, desarrollamos un modelo matemático para el módulo de polarización celular de la levadura en ciernes, sintetizando los conocimientos de una gran cantidad de literatura experimental y teórica. Nuestro análisis teórico de este modelo muestra que el módulo de polaridad celular comprende múltiples mecanismos redundantes basados ​​en reacción-difusión y transporte potencialmente basado en vesículas. Revela que, además del mecanismo de reclutamiento mutuo mediado por Bem1, existe un mecanismo distinto y latente en la maquinaria de polarización de Cdc42. Fundamentalmente, este mecanismo latente requiere un modelado explícito del complejo intermedio Cdc42-GAP, que no fue tenido en cuenta en modelos anteriores. Mostramos que el mecanismo latente opera bajo diferentes restricciones en el número de copias de proteínas que el mecanismo de tipo salvaje y se activa por la pérdida de Bem3, que reduce el número total de copias de proteínas de GAP. Esto explica cómo se rescata la polarización celular en las células bem1Δ bem3Δ3, y también concilia los desconcertantes hallazgos experimentales descritos anteriormente. Además, confirmamos experimentalmente las predicciones de nuestra teoría sobre cómo se puede rescatar la polarización celular en varios mutantes cambiando el número de copias de la proteína Cdc42. Sobre la base de la comprensión mecanicista del módulo de polarización celular en la levadura en ciernes, proponemos un posible escenario evolutivo para el surgimiento de esta función celular autoorganizada. Formulamos una hipótesis concreta según la cual la evolución podría aprovechar las proteínas de andamio para introducir nuevas conexiones en una red existente y así aumentar la redundancia de mecanismos dentro de un módulo celular funcional. Esta redundancia afloja las limitaciones del módulo y, por lo tanto, permite una mayor evolución de sus componentes, por ejemplo mediante duplicación y subfuncionalización24.

Como base para nuestro análisis teórico, primero debemos formular un modelo matemático de la maquinaria de polarización Cdc42 de las células que sea capaz de explicar la polarización independiente de Bem1. La interacción de los procesos de transporte espacial (Fig. 1a, c) y las interacciones proteína-proteína (Fig. 1d) se describe en el marco de la dinámica de reacción-difusión. La red de interacción bioquímica que proponemos se basa en el modelo cuantitativo introducido en 12 y le realiza varias extensiones mínimas, pero esenciales. El modelo tiene en cuenta el ciclo de la Cdc42 GTPasa y las interacciones entre Cdc42, Bem1 y Cdc2410. Ampliando los modelos anteriores, incorporamos explícitamente la formación transitoria de un complejo GAP-Cdc42 como un paso intermedio en la interacción enzimática entre GAP y Cdc4225. Es importante tener en cuenta explícitamente la cinética enzimática de las GAP, que se descuidó en modelos anteriores26,27,28, para tener en cuenta la saturación (parcial) de GAP en regiones de alta concentración de Cdc42. De hecho, esta saturación enzimática es una propiedad genérica de la cinética enzimática. Desempeñará un papel esencial en nuestros hallazgos. También incluimos el autorreclutamiento efectivo de Cdc42-GDP en la membrana, que es facilitado por Cdc42-GTP unido a la membrana. Este reclutamiento efectivo explica el transporte de Cdc42 basado en vesículas a lo largo de los cables de actina11,29,30 y las supuestas vías de reclutamiento mediadas por efectores posteriores de Cdc42-GTP como Cla4 y Gic1/231,32,33. En la Nota complementaria 1 se proporciona una descripción detallada del modelo, ilustrada en la Fig. 1d, y una motivación biológica detallada para los supuestos subyacentes.

Primero preguntamos si el modelo de reacción-difusión propuesto de la maquinaria de polarización de Cdc42 puede explicar la polarización espontánea en ausencia de Bem1, es decir, sin colocalización del GEF con Cdc42. Para ello, realizamos un análisis de estabilidad lineal del modelo que identifica los regímenes de formación de patrones autoorganizados. Un estudio de parámetros a gran escala (consulte la Nota complementaria 4) revela que, en ausencia de Bem1, existe un rango de números de proteínas de Cdc42 y GAP donde los patrones polares son posibles (Fig. 2b), es decir, que existe un mecanismo de polarización latente. . Sin embargo, a diferencia del mecanismo de reclutamiento mutuo dependiente de Bem1 (Fig. 2a), encontramos que el régimen de operación de este mecanismo latente es más limitado y requiere una relación de concentración de GAP/Cdc42 suficientemente baja (Fig. 2b). Para validar los resultados del análisis de estabilidad lineal, realizamos simulaciones numéricas de las difusiones de reacción acopladas a la superficie masiva no lineales completas (ver Fig. 2c y Videos 1 a 6; detalles descritos en la Nota complementaria 3).

Diagramas de estabilidad en función de las concentraciones de GAP y Cdc42 en presencia y ausencia de Bem1 obtenidos mediante análisis de estabilidad lineal (ver Nota complementaria 2) del modelo matemático para la maquinaria de polarización de Cdc42 (ver Métodos). Las áreas sombreadas indican regímenes de inestabilidad lateral, es decir, donde es posible una polarización espontánea. a En las células WT, la proteína de andamio Bem1 está presente y facilita la polarización espontánea mediante un mecanismo de reclutamiento mutuo que funciona en un amplio rango de concentraciones de Cdc42 y GAP10,12. El punto verde marca las concentraciones de Cdc42 y GAP de las células WT. b En ausencia de Bem1, la polarización espontánea está restringida a una región de espacio de parámetros mucho más pequeña en nuestro modelo, porque el régimen de operación del mecanismo independiente de Bem1 está inherentemente delimitado por una relación crítica entre la concentración de GAP y la concentración de Cdc42. Las concentraciones de Cdc42 y GAP de las células bem1Δ y bem1Δ bem3Δ están marcadas con la cruz roja y el punto azul, respectivamente. La observación experimental de que las células bem1Δ no se polarizan, mientras que bem1Δ bem3Δ se polarizan, se puede utilizar para inferir un rango para la relación crítica de concentración de GAP/Cdc42. El aumento de la actividad GEF de Cdc24 aumenta esta proporción crítica (línea azul discontinua). c Instantáneas de simulaciones numéricas que muestran la concentración de Cdc42-GTP unido a la membrana en el estado estacionario final para diversas condiciones de número de copias y mutantes, correspondientes a los vídeos 1 a 4. (En el panel (iii), la barra de color representa concentraciones en el rango de 0 a 200 µm–2). (Los parámetros del modelo se obtuvieron mediante muestreo de conjuntos de parámetros que son consistentes con los hallazgos experimentales en varios mutantes, como se describe en detalle en la Nota complementaria 4; consulte las figuras complementarias S3 y S4 y las tablas complementarias S2-S4).

¿Cuál es la causa mecanicista de la restricción en la relación de concentración de GAP/Cdc42? Para responder a esta pregunta, debemos comprender cómo funciona el mecanismo de polarización de Cdc42 en ausencia de Bem1. Como se enfatizó anteriormente, la polarización de Cdc42 requiere dos características esenciales: transporte dirigido de Cdc42 a la zona polar y activación localizada de Cdc42 allí. La primera característica, el transporte dirigido, se explica en el modelo mediante el reclutamiento efectivo de Cdc42-GDP en la membrana mediado por Cdc42 activo (Fig. 1d).

¿Cómo se implementa la segunda característica, la localización de la actividad de Cdc42 en la zona polar, en ausencia de Bem1? En lugar de aumentar directamente la tasa de activación de Cdc42 en la zona polar (mediante el reclutamiento del GEF Cdc24 por Bem1), la localización de la actividad también se puede lograr disminuyendo la tasa de desactivación de Cdc42 en la zona polar y aumentándola fuera de la zona polar. . De hecho, si la saturación de la enzima limita la tasa neta de desactivación, un simple aumento en la densidad de Cdc42 generalmente conduce a una disminución de la tasa de desactivación de Cdc42 (por molécula de Cdc42). La saturación enzimática de reacciones catalíticas ocurre cuando la disociación del complejo transitorio enzima-sustrato (aquí el complejo GAP-Cdc42) es el paso limitante de la velocidad. Las enzimas que están secuestradas transitoriamente en complejos enzima-sustrato no están disponibles para unirse a otras moléculas de sustrato. De hecho, se ha demostrado que este es el caso de la hidrólisis de Cdc42 catalizada por GAP en levaduras en ciernes25. Además, la saturación de enzimas requiere que una gran fracción de enzimas esté secuestrada en complejos enzima-sustrato, es decir, que la densidad total de enzima sea suficientemente baja en comparación con la densidad del sustrato, como encontramos en el análisis de estabilidad lineal (Fig. 2b).

En resumen, la saturación (parcial) de GAP localiza la actividad de Cdc42 en la zona polar: disminuye la tasa de desactivación en la zona polar, donde la densidad de Cdc42 es alta, en relación con el resto de la membrana, donde la densidad de Cdc42 es baja. Esta actividad localizada de Cdc42, junto con el transporte de Cdc42 a la zona polar, impulsa la polarización celular espontánea. Curiosamente, la saturación enzimática de la hidrólisis de Cdc42 es uno de los seis mecanismos teóricamente posibles para la formación de patrones que se plantearon como hipótesis mediante un análisis matemático genérico de los bucles de retroalimentación en los ciclos de GTPasa34.

El mecanismo de rescate independiente de Bem1 requiere una relación de concentración de GAP/Cdc42 suficientemente baja para ser funcional (Fig. 2b). Esto sugiere que las células bem1Δ no pueden polarizarse porque su número de copias de la proteína GAP es demasiado alto. Nuestro modelo predice que la pérdida de GAP puede rescatar la polarización celular al llevar su número total de copias de proteínas a un régimen en el que el mecanismo independiente de Bem1 esté operativo, como lo indica la flecha en la Fig. 2b. Esto está de acuerdo con experimentos de evolución que muestran que las células bem1Δ son rescatadas de manera reproducible mediante una mutación posterior de pérdida de función de GAP Bem33. Bem3 representa aproximadamente el 25% del número total de copias de proteínas de todos los Cdc42-GAP35, lo que indica que los mutantes bem1Δ están cerca del umbral de la relación GAP/Cdc42 del mecanismo independiente de Bem1. Esta proximidad del número de copias de proteínas al umbral explica por qué una fracción baja (aproximadamente 1 en 105) de mutantes es capaz de polarizarse y dividirse, después de que se ha eliminado BEM13: los números de copias de proteínas varían estocásticamente de una célula a otra, de modo que una pequeña fracción de las células radica en el régimen de concentración donde el mecanismo de polarización latente impulsa la polarización celular espontánea. (Para los cuatro GAP de Cdc42, se ha informado un coeficiente de variación de alrededor de 0,14 para la variabilidad del número de copias de célula a célula36. Esto está en el mismo orden de magnitud que la estimación superior del 25 % para la reducción requerida del número de copias de la proteína GAP. para activar el mecanismo de rescate independiente de Bem1, lo que sugiere que este mecanismo está operativo en una fracción de células bem1Δ).

En lugar de por la pérdida de un GAP, la relación de concentración de GAP/Cdc42 también podría reducirse mediante un aumento del número de copias de la proteína Cdc42. Otra opción más sería un aumento de la actividad del FMAM de Cdc24, lo que aumentaría el umbral crítico en la relación de concentración de GAP/Cdc42 (ver línea discontinua en la Fig. 2b). Sin embargo, en comparación con una mutación por pérdida de función, dichas mutaciones tienen un tamaño objetivo mutacional mucho más pequeño y, por lo tanto, son mucho menos frecuentes. Además, uno podría preguntarse por qué es específicamente Bem3, en lugar de uno de los otros GAP, el que se pierde para rescatar la cepa bem1Δ. Algunas sugerencias para responder a esta pregunta pendiente se proporcionan en un análisis teórico detallado del mecanismo de rescate más adelante en la sección "Submódulos funcionales de la polarización celular".

Con base en la restricción de la relación GAP/Cdc42 en el mecanismo de rescate, nuestra teoría hace dos predicciones específicas: (i) Aumentar el número de copias de la proteína (es decir, sobreexpresión) de Cdc42 rescatará la polarización celular de las células bem1Δ invocando el mecanismo independiente de Bem1. (ii) La polarización de las células bem1 Δbem3Δ se descompondrá si el número de copias de la proteína Cdc42 se reduce en comparación con el nivel WT (Fig. 2b).

Para probar experimentalmente estas predicciones del modelo, primero construimos diferentes cepas de levadura con Cdc42, marcada con sfGFP, bajo un promotor de galactosa inducible. Esto nos permite ajustar el número de copias de la proteína Cdc42 variando la concentración de galactosa en los medios de crecimiento: una cepa bem1Δ (yWKD069), una bem1Δ bem3Δ (yWKD070) y una cepa WT modificada (yWKD065) (ver Métodos). Confirmamos que la etiqueta sfGFP en nuestro Cdc42 inducible no altera significativamente la aptitud (consulte la Nota complementaria 6.2), de acuerdo con la literatura sobre la viabilidad y localización de otra fusión tipo sándwich de Cdc42 fluorescente en levadura en ciernes. Como siguiente paso, inoculamos las diferentes cepas con diferentes concentraciones de galactosa en placas de 96 pocillos, que se colocaron en un lector de placas para medir la densidad celular a lo largo del tiempo y, de ese modo, determinamos la tasa de crecimiento de la población (ver Métodos). Para cada concentración de galactosa, las tasas de crecimiento se normalizan con respecto a las de las células WT, con Cdc42 bajo su promotor nativo (yLL3a), cultivado a la misma concentración de galactosa. En la Fig. 3a se representan las tasas de crecimiento normalizadas de los diferentes mutantes. Como era de esperar, las células WT crecen en todas las concentraciones de galactosa. Por el contrario, las células WT con Cdc42 bajo el promotor de galactosa (yWKD065), no crecen en ausencia de Cdc42 (concentración de galactosa del 0%), ya que una falla en la polarización perjudica gravemente la división celular y eventualmente conduce a la muerte celular y, por lo tanto, a una tasa de crecimiento cero. . Nuestros datos muestran que el mecanismo WT es bastante insensible al número de copias de la proteína Cdc42, incluso para una expresión muy baja de Cdc42, de acuerdo con la teoría (Fig. 2a).

a La tasa de crecimiento relativa (aptitud) de los mutantes en función de la concentración de galactosa (representante del número de copias de la proteína Cdc42) muestra que una mayor expresión de Cdc42 rescata las células bem1Δ y, en menor medida, las células bem1Δ bem3Δ. Los marcadores indican las medias de la distribución de probabilidad posterior para la aptitud, las barras de error indican los intervalos de credibilidad del 68% (ver Métodos). Las grandes barras de error se deben a la variabilidad entre réplicas técnicas y a que en algunas condiciones, por ejemplo, bem1Δ con 0,03% de galactosa, el crecimiento es muy poco frecuente (consulte la Nota complementaria 6.1). El número de experimentos por par de cepa-condición se proporciona en la Tabla complementaria S5. Para conocer las tasas de crecimiento absolutas (no normalizadas a WT), consulte la Figura complementaria S6. b Micrografías de todas las cepas en galactosa al 0,06%, después de 24 h de incubación. Las células de levadura WT con Cdc42 bajo galactosa y promotor nativo respectivamente están entrando en fase estacionaria y se diluyen 1000 × (fila superior). Las células bem1Δ y bem1Δ bem3Δ están en fase logarítmica y diluidas 100 × (fila inferior).

Nuestro modelo predice que las células bem1Δ necesitan el mayor número de copias de la proteína Cdc42 para polarizarse, las células WT necesitarán menos y las células bem1Δ bem3Δ deberían estar en el medio. De hecho, encontramos que la cepa bem1Δ (yWKD069) crece en medios con una concentración de galactosa del 0,1% o más. Inoculamos estas cepas en concentraciones más bajas de galactosa, pero nunca observamos crecimiento de las cepas bem1Δ y bem1Δbem3Δ en más de una réplica técnica (de 6 y 4 respectivamente) por condición (consulte la Tabla complementaria S3). Atribuimos el raro crecimiento en concentraciones bajas de galactosa a la aparición de mutaciones supresoras. Por lo tanto, nos centramos en comparar tasas de crecimiento. Existe evidencia sólida y positiva de que bem1Δbem3Δ crece más rápido que bem1Δ en concentraciones de galactosa de 0.06%, 0.1% y 0.2% respectivamente (factores de Bayes 7, 131 y 6, y utilizando calificaciones de interpretación de la referencia 39). Para las células WT con Cdc42 bajo el promotor de galactosa, observamos una tasa de crecimiento reducida a una concentración de galactosa del 0,01%, pero el crecimiento solo se inhibe completamente a una concentración de galactosa del 0%. Todas las observaciones experimentales anteriores concuerdan con nuestras predicciones teóricas específicas.

Además, examinamos la influencia del número de copias de la proteína Cdc42 en la morfología celular (ver Fig. 3b) y la viabilidad como se analiza en el Material complementario. Estos experimentos respaldan las conclusiones de nuestros ensayos de crecimiento, es decir, que la viabilidad aumenta y el tamaño (como indicador del tiempo de polarización3,40) disminuye al aumentar el número de copias de proteínas.

En conjunto, los datos experimentales confirman la predicción teórica de que el mecanismo de rescate independiente de Bem1 solo funciona por debajo de un umbral de relación de concentración de GAP/Cdc42. Además, encontramos que el mecanismo WT dependiente de Bem1 es sorprendentemente insensible al número de copias de la proteína Cdc42, es decir, también opera a concentraciones muy bajas de Cdc42. En el contexto de nuestra teoría, esta diferencia significativa en la sensibilidad del número de copias de la proteína Cdc42 se explica por la diferencia cualitativa de sus principios de funcionamiento (ver "La red de interacción Cdc42 facilita un mecanismo de polarización latente"). El mecanismo WT se basa en el reclutamiento del GEF Cdc24 en la zona polar, mediado por la proteína de andamio Bem1. Por el contrario, el mecanismo de rescate implica de manera crucial la saturación enzimática de la hidrólisis de Cdc42 debido a la alta densidad de Cdc42 en la zona polar. Esta saturación enzimática requiere un número de copias de la proteína Cdc42 suficientemente grande en relación con el número de copias de la proteína GAP. En la sección “Submódulos funcionales de polarización celular” a continuación, analizaremos con más detalle el modelo matemático y las diferencias cualitativas y conceptuales entre estos dos mecanismos.

En experimentos anteriores, se estudiaron varios mutantes de Bem1 que perturban la capacidad de Bem1 para mediar la co-localización de Cdc24 a Cdc42-GTP, la característica clave que subyace al funcionamiento del mecanismo WT17,20,21,41,42,43. Las observaciones de estos experimentos siguen siendo desconcertantes y aparentemente contradictorias entre sí hasta el momento. Como mostramos en detalle en la Discusión complementaria de la Nota complementaria 5, el mecanismo de rescate latente predicho por nuestro modelo matemático explica y concilia todos estos hallazgos experimentales previos. La idea clave es que el mecanismo de rescate latente puede activarse mediante un aumento global de la actividad del FMAM (ver línea discontinua en la Fig. 2b). Los mutantes Bem1 que carecen del dominio de interacción Cdc42 pero que aún se unen al GEF Cdc24 pueden proporcionar un aumento global de la actividad del GEF y así rescatar la polarización de las células bem1Δ. Además, de acuerdo con experimentos de optogenética43, nuestro modelo matemático predice que el mecanismo latente independiente de Bem1 también puede inducirse fuera del régimen de polarización espontánea mediante una perturbación local suficientemente fuerte de la concentración de GEF unida a la membrana.

La polarización celular en la levadura en ciernes es un módulo funcional basado en una compleja red de interacción de proteínas con Cdc42 como proteína de polaridad central (cf. Fig. 1b-d). Como veremos a continuación, la red completa se puede dividir en submódulos funcionales. Aquí, el término submódulo funcional se refiere a una parte de la red de interacción completa con una función bien definida en uno o más mecanismos de formación de patrones. Nuestro análisis teórico revelará que una interacción de dos (o más) submódulos funcionales constituye cada uno de ellos un mecanismo de polarización celular completamente funcional. Es importante destacar que los submódulos surgen de la interacción de varios actores (componentes) en la red de interacción bioquímica y el transporte espacial de proteínas (por difusión y a lo largo de cables de actina).

Como argumentamos en la "Introducción", el establecimiento y mantenimiento de la polaridad celular requiere que la actividad de Cdc42 se localice en regiones de membrana con una alta densidad de Cdc42. Esto se puede lograr de dos maneras diferentes. Primero, mediante el reclutamiento de la proteína de andamio Bem1 a Cdc42-GTP, que a su vez recluta el GEF (Cdc24) y así localiza la activación de Cdc42 en la zona polar, donde la densidad de Cdc42 es alta (Fig. 4a, arriba a la izquierda). A esto lo llamamos submódulo de activación polar. En segundo lugar, la saturación de GAP en regiones de altas densidades locales de Cdc42 puede localizar la actividad de Cdc42 en la zona polar (Fig. 4a, arriba a la derecha), como se describe anteriormente en la subsección "La saturación de GAP puede localizar Cdc42 en la zona polar". El secuestro transitorio (parcial) de GAP en complejos Cdc42-GAP es esencial para este submódulo de saturación de GAP polar. El tercer submódulo (Fig. 4a, abajo) que denominamos transporte de Cdc42, comprende varios modos de transporte de Cdc42 hacia la zona polar: transporte de vesículas a lo largo de cables de actina polarizados (ver Fig. 1b) y (auto) reclutamiento efectivo de Cdc42 desde el citosol. Varios experimentos indican que los efectores posteriores de Cdc42 activo, como Cla4, Gic1 y Gic2, pueden proporcionar un reclutamiento tan efectivo en ausencia de Bem131,33,44.

a Tres submódulos funcionales de la red de interacción Cdc42 contribuyen a la formación y mantenimiento de una zona polar (región de alta concentración de Cdc42-GTP, resaltada en rojo): Transporte de Cdc42 hacia la zona polar (círculo violeta). Se puede mantener una alta actividad de Cdc42 debido a la saturación de GAP en la zona polar (cuadrado verde azulado) y mediante el transporte del GEF a la zona polar a través de la proteína de andamio Bem1 (triángulo amarillo). b Las combinaciones de pares de estos submódulos funcionales constituyen mecanismos de formación de patrones autoorganizados. c – e Estos mecanismos funcionan en diferentes regímenes del número total de copias de proteínas de Cdc42 y GAP. El mecanismo WT (f) es en gran medida insensible a las variaciones del número de copias de proteínas (c) porque se basa en el reclutamiento mutuo de los complejos Cdc42 y Bem1-GEF, y no depende de la saturación de GAP en la zona polar. Por el contrario, cuando el GEF no se transporta a la zona polar (por ejemplo, debido a una eliminación de Bem1), sólo la saturación de GAP en la zona polar mantiene una alta actividad de Cdc42 allí, mientras que la desactivación domina fuera de la zona polar. Por lo tanto, el mecanismo de polarización (g) es sensible al número de copias de la proteína GAP (d). h Sorprendentemente, si se suprime el transporte de Cdc42, por ejemplo, uniéndolo fuertemente a la membrana, una combinación de reclutamiento del complejo Bem1-GEF y saturación polar de GAP mantiene una alta actividad localizada de Cdc42 incluso aunque la densidad total de Cdc42 esté distribuida de manera homogénea.

Estos tres submódulos funcionales representan diferentes aspectos mecanicistas de la red de interacción Cdc42. Cada submódulo es operativo sólo bajo restricciones específicas sobre las propiedades bioquímicas y el número de copias de proteínas de las proteínas involucradas. A continuación, aprovechamos estas restricciones para estudiar las funciones de los submódulos en el modelo matemático deshabilitándolos uno a la vez. Esto nos permite separar los mecanismos que funcionan en las condiciones experimentales correspondientes. El primer submódulo, la activación polar, se desactiva mediante la desactivación de Bem1. El segundo submódulo, la saturación de GAP polar, se suprime si el número de copias de proteína de GAP es demasiado alto. Alternativamente, la saturación de GAP polar deja de ser operativa si la velocidad de disociación del complejo GAP-Cdc42 es demasiado rápida, o si los GAP libres se difunden muy rápidamente, lo que hace que los GAP libres adicionales estén fácilmente disponibles en la zona polar. El tercer submódulo, el transporte de Cdc42, se puede desactivar inmovilizando Cdc42, es decir, suprimiendo su redistribución espacial. Experimentalmente, esto se ha logrado en levaduras de fisión fusionando Cdc42 con una proteína transmembrana que se une fuertemente a la membrana y permanece casi inmóvil allí41.

Vale la pena señalar que Bem1 es parte de dos submódulos funcionales: el reclutamiento de GEF en la zona polar proporciona activación polar, el reclutamiento de Cdc42 contribuye al transporte de Cdc42. Si bien la activación polar depende completamente de Bem1, existen varios modos de transporte de Cdc42 independientes de Bem1, incluido el tráfico de vesículas basado en actina y otros supuestos mecanismos de reclutamiento (cf. Fig. 1d). Por tanto, el submódulo de transporte Cdc42 todavía está operativo en las células bem1Δ.

A continuación, realizamos un análisis de estabilidad lineal para el modelo matemático completo bajo cada una de estas perturbaciones, deshabilitando uno de los submódulos a la vez (como se describe en detalle en la Nota complementaria 4; consulte la Tabla complementaria S3). En cada caso, encontramos que los dos submódulos restantes operan en conjunto para constituir un mecanismo para la polarización espontánea de Cdc42, como se ilustra en la Fig. 4b. La Figura 4c-e muestra el régimen de funcionamiento de los tres mecanismos diferentes en función de las concentraciones totales de Cdc42 y GAP. Las Figuras 4f-h ilustran la interacción concertada del transporte dirigido de proteínas y la regulación de la actividad de Cdc42 (activación/desactivación) que subyacen a la polarización de Cdc42 en estos tres mecanismos.

Antes de pasar a las descripciones detalladas de estos mecanismos, observamos que si dos submódulos se desactivan simultáneamente, el submódulo restante por sí solo no puede facilitar la formación de patrones. En particular, y quizás de manera algo contraria a la intuición, el autorreclutamiento de Cdc42 por sí solo no es suficiente para impulsar la polarización celular espontánea34,45.

La interacción del submódulo de transporte Cdc42 y el submódulo de reclutamiento Cdc42-Bem1-Cdc24 (activación polar), ilustrada en la Fig. 4f, constituye el mecanismo WT que opera mediante el reclutamiento mutuo de Cdc42 y Bem18,11,12. La característica de este mecanismo es la colocalización de Cdc24 y Cdc42-GTP en la zona polar, como se observó en experimentos anteriores42,43. Aparte del mecanismo de rescate, el mecanismo de reclutamiento mutuo no requiere una saturación polar de GAP. Por lo tanto, es insensible a altas concentraciones de GAP, es decir, es operativo para relaciones de concentración de GAP/Cdc42 mucho más altas que el mecanismo de rescate. Además, es resistente a la alta difusividad de los GAP libres y a las altas tasas catalíticas de los GAP (desintegración rápida de los complejos GAP-Cdc42 en GAP y Cdc42-GDP libres). Esto implica que en los modelos matemáticos del mecanismo WT las GAP pueden explicarse implícitamente mediante una tasa de hidrólisis constante y homogénea, como en modelos anteriores10,12,42,46. En particular, Bem1 media tanto la activación polar como el transporte de Cdc42 (mediante el reclutamiento desde el citosol) en estos modelos.

El mecanismo de rescate latente independiente de Bem1 opera mediante la interacción de la saturación de GAP en la zona polar (ilustrada en la Fig. 4g) y el transporte de Cdc42 (incluido el autorreclutamiento efectivo a través de actina y/u otros efectores posteriores como Cla4). La característica de este mecanismo es que no requiere la colocalización de Cdc24 a Cdc42-GTP en la zona polar (ver Fig. 4g). En experimentos futuros, esta falta (o fuerte reducción) de la polarización de Cdc24 podría servir como un indicador claro del mecanismo de rescate. Como se explicó anteriormente, el mecanismo de rescate se basa en la saturación de GAP en la zona polar para mantener una alta actividad de Cdc42 allí. Cuando la actividad de Cdc42 se mantiene mediante una menor actividad de GAP, esperamos tiempos de residencia más prolongados de Cdc42 en la zona polar en comparación con las células WT. Esta predicción podría probarse en experimentos futuros.

La saturación de GAP se suprime ya sea por una gran abundancia, una alta actividad catalítica o un transporte rápido (por difusión citosólica o reciclaje de vesículas) de los GAP. La última restricción proporciona una explicación plausible de por qué es específicamente Bem3 el que debe eliminarse para rescatar las células bem1Δ. A diferencia de Rga1 y Rga2, se ha descubierto que Bem3 es muy móvil, probablemente porque circula a través del citosol47. La saturación de GAP, es decir, el agotamiento de los GAP libres en la zona polar, implica un gradiente de la densidad de GAP libres hacia la zona polar. Una especie de GAP móvil como Bem3 se difundirá rápidamente a lo largo de este gradiente para reponer los GAP libres en la zona polar. Esta afluencia alivia la saturación de GAP allí y contrarresta así la activación de Cdc42 en la zona polar incipiente. Por lo tanto, la pérdida de Bem3, en lugar de uno de los otros GAP menos móviles, promueve la formación de una zona polar estable.

La interacción del reclutamiento de Cdc42-Bem1-Cdc24 (activación polar) y la saturación de GAP polar, ilustrada en la Fig. 3H, facilita la polarización de la actividad de Cdc42 sin la redistribución espacial de la densidad total de Cdc42 (línea azul en la Fig. 3h, arriba). En cambio, las proteínas que se están redistribuyendo son Bem1 y GEF. La zona polar se caracteriza por una alta concentración de complejos Bem1-GEF unidos a la membrana que aumentan localmente la actividad de Cdc42. Cdc42-GTP, a su vez, recluta más moléculas Bem1 y GEF en la zona polar. La característica de este mecanismo es que Cdc42-GTP está polarizado mientras que la densidad total de Cdc42 permanece uniforme en la membrana. Experimentalmente, esto se ha observado en levaduras de fisión utilizando Cdc42 fusionado a un dominio transmembrana (Cdc42-psy1TM) que deja a Cdc42 casi inmóvil. La maquinaria de polarización de la levadura de fisión está estrechamente relacionada con la de la levadura en ciernes; Opera basándose en la misma vía de reclutamiento mutuo con Scd1 y Scd2 asumiendo los roles de Cdc24 y Bem114. En experimentos futuros, sería interesante probar si Cdc42-psy1TM también facilita la polarización en levaduras en ciernes (potencialmente en una cepa con un número de copias de proteína GAP o Cdc42 modificado, ya que el régimen de operación podría no coincidir con los números de copias de la proteína WT).

Hemos descubierto que múltiples mecanismos de autoorganización redundantes coexisten dentro de la red de proteínas que subyace a la polarización celular en la levadura en ciernes. Esto explica la notable resiliencia de este módulo: permanece operativo bajo muchas perturbaciones experimentales (genéticas)13,20,21,41,43,48. Si bien descubrimos que la maquinaria de polarización de Cdc42 es robusta frente a muchas perturbaciones genéticas, nos hemos centrado especialmente en uno de sus componentes clave, Bem1, ya que un experimento anterior encontró una recuperación rápida y reproducible de su eliminación3. Al diseccionar el módulo de polarización celular completo en submódulos funcionales, hemos identificado tres mecanismos distintos de formación de patrones autoorganizados. Además del mecanismo de tipo salvaje que se basa en la colocalización de Cdc42 con su GEF a través de Bem1, esto incluye un mecanismo de rescate latente e independiente de Bem1 y un mecanismo que es independiente de la redistribución de Cdc42. Nuestra teoría, que es compatible con los experimentos publicados, revela que estos mecanismos comparten muchos componentes y vías de interacción de esta red. Esto implica que la redundancia de la polarización celular no se produce al nivel de componentes o interacciones individuales, sino que surge al nivel de la función emergente misma. Si un submódulo deja de funcionar, la combinación de los submódulos restantes aún constituye un mecanismo operativo de polarización celular, si los parámetros, en particular los números de copias de proteínas, se ajustan a un régimen de parámetros en el que estos submódulos restantes estén operativos. Por lo tanto, la redundancia proporciona adaptabilidad: la capacidad de mantener la función a pesar de las perturbaciones (genéticas). Es importante destacar que los submódulos son emergentes: implican la interacción de varios componentes de la red, sus interacciones bioquímicas y su transporte espacial.

Nuestro análisis en términos de submódulos funcionales proporciona una comprensión mecanicista de la maquinaria de polarización donde los detalles moleculares han sido "gruesos". En el contexto de los mapas de genotipo-fenotipo, esta descripción general podría integrarse en un modelo de ciclo celular para abordar cuestiones sobre la epistasis49 y, eventualmente, predecir trayectorias evolutivas en un modelo de dinámica de poblaciones.

Curiosamente, la formación de patrones de proteína Min en E. coli se basa en el mismo tipo de mecanismo que el mecanismo de rescate para la polarización de Cdc42: el autorreclutamiento de una ATPasa (MinD) y la saturación enzimática de la AAP (MinE) que cataliza la proteína Min. hidrólisis y posterior disociación de la membrana50,51,52. Los complejos MinDE transitorios desempeñan aquí un papel análogo a los complejos Cdc42-GAP: en regiones de alta densidad de MinD, MinE se secuestra en complejos MinDE, lo que limita la velocidad de hidrólisis hasta que los complejos se disocian o MinE adicional ingresa por difusión. Debido a que MinE circula a través del citosol, se difunde rápidamente hacia la zona polar donde la densidad de MinE libre es baja. Este influjo difusivo alivia la saturación de enzimas en la zona polar y eventualmente conduce a una inversión de la dirección de polaridad MinD. El cambio repetido de la polaridad MinD debido a la redistribución de MinE es lo que da lugar a las oscilaciones Min en E. coli. Recientemente también se han observado patrones Min estacionarios in vitro53. Por el contrario, la dinámica oscilatoria de Cdc42 se encuentra en la levadura de fisión S. Pombe32 y también se ha observado indirectamente en mutantes de levadura en ciernes46,54.

La pregunta fundamental de la biología celular evolutiva es “¿Cómo funcionan las células y cómo llegaron a ser como son?”55. Nuestro análisis en profundidad de la maquinaria de polarización de la levadura da una respuesta a la primera mitad de esta pregunta para un sistema biológico específico. También nos permite acercarnos a la segunda mitad y desarrollar una hipótesis concreta sobre cómo la maquinaria de polarización celular Cdc42 de la levadura en ciernes podría haber evolucionado a partir de una forma ancestral más rudimental.

Nuestros resultados teóricos y experimentales resaltan la importancia del número de copias de proteínas como parámetros de control que determinan si un mecanismo de polarización celular espontánea está operativo. Expresado desde una perspectiva genética, los genes que codifican componentes de la maquinaria de polarización celular son sensibles a la dosis56. Por un lado, esto implica que las mutaciones de elementos reguladores cis (como promotores y potenciadores)57 pueden ajustar el número de copias de proteínas al régimen de funcionamiento de un mecanismo de polarización celular específico y optimizar la función dentro de ese régimen. Por otro lado, la sensibilidad del número de copias de proteínas limita la evolución de los componentes de la maquinaria de polarización mediante duplicación y subfuncionalización56,58.

Uno de nuestros hallazgos clave es que las limitaciones de un único mecanismo particular pueden sortearse mediante la coexistencia de varios mecanismos redundantes de autoorganización que operan dentro de la misma red de interacción de proteínas. Los regímenes de operación (y, por tanto, la sensibilidad a la dosis de genes específicos) pueden diferir enormemente entre estos distintos mecanismos. Por lo tanto, la redundancia a nivel de mecanismos permite que los componentes del módulo superen limitaciones como la sensibilidad al número de copias de proteínas y, por lo tanto, promueve la "capacidad de evolución": el potencial de los componentes para adquirir nuevas (sub)funciones manteniendo la función original del módulo. Trabajos anteriores han demostrado cómo bucles de retroalimentación negativa adicionales también pueden aumentar el régimen de funcionamiento del mecanismo WT28.

Un ejemplo particular en el módulo de polarización celular de la levadura en ciernes donde podría haber tenido lugar la duplicación y subfuncionalización es la diversificación de las diferentes GAP de Cdc42 en la levadura en ciernes. Bem3, Rga1 y Rga2 desempeñan funciones individuales en funciones celulares específicas, como la vía de respuesta de feromonas47,59, la gemación axial60 y el momento de la polarización61; consulte 62 para una visualización. En el origen de esta diversidad de GAP está su promoción mediante mecanismos de polarización celular que son insensibles al número de copias de la proteína GAP, como el mecanismo WT mediado por Bem1. Como argumentaremos más adelante, esta noción proporciona una hipótesis concreta sobre el papel de las proteínas de andamio, como Bem1, para la evolución de módulos funcionales que operan mediante la interacción de muchos componentes que interactúan.

En el contexto de los procesos de señalización celular, se sugirió anteriormente que la evolución podría aprovechar las proteínas de andamio para desarrollar nuevas funciones para las proteínas ancestrales regulando la selectividad en las vías, dando forma a los comportamientos de salida y logrando nuevas respuestas a partir de componentes de señalización preexistentes63. Nuestro estudio de la maquinaria de polarización de Cdc42 brinda una perspectiva sobre cómo las proteínas de andamio también pueden desempeñar un papel importante en la evolución de la autoorganización intracelular. La proteína de andamio Bem1, al conectar Cdc42-GTP al GEF de Cdc42, genera un submódulo funcional que contribuye a la polarización autoorganizada de Cdc42. Con base en esto, proponemos una historia evolutiva hipotética para Bem1, ilustrada en la Fig. 5: El mecanismo de rescate latente es genérico y rudimentario y, por lo tanto, podría ser un mecanismo ancestral de polarización de Cdc42 en hongos. Sobre esta base, Bem1 podría haber evolucionado paso a paso: un hipotético precursor de Bem1 que se une a Cdc24 pero no a Cdc42-GTP podría haber facilitado una actividad catalítica mejorada globalmente de Cdc24 al aliviar su autoinhibición22,23. Nuestra teoría muestra que tal aumento de la actividad del FMAM amplía el rango de proporciones de concentración de GAP/Cdc42 para las cuales está operativo el mecanismo de rescate latente. Esto habría implicado una ventaja evolutiva al aumentar la robustez del (hipotético) mecanismo ancestral contra las variaciones en el número de copias de proteínas. En un paso posterior, el precursor de Bem1 podría haber obtenido el dominio de unión a Cdc42 (dominio SH3) mediante la fusión del dominio64, formando así la proteína de andamio completa que conecta Cdc24 con Cdc42-GTP que media el mecanismo de polarización WT (reclutamiento mutuo de Cdc24 y Cdc42). A lo largo de esta hipotética trayectoria evolutiva, las limitaciones sobre la relación del número de copias de la proteína GAP/Cdc42 y las propiedades moleculares de las GAP (tasas cinéticas, afinidades de membrana) se relajarían, permitiendo así la duplicación y subfuncionalización de las GAP58. Dado que Bem1 está altamente conservado en los hongos2 y que la polarización de la levadura por fisión se basa en el mismo mecanismo de reclutamiento mutuo65,66, esta vía evolutiva hipotética podría pertenecer al pasado.

(Izquierda) El mecanismo de "rescate" independiente de Bem1 basado en la saturación de GAP y el transporte de Cdc42 hacia Cdc42-GTP unido a la membrana funciona solo en un rango limitado de relaciones de concentración de GAP/Cdc42 (cf. Fig. 4d). (Centro) un precursor de Bem1 (fragmento de Bem1) que se une a Cdc24 y alivia su autoinhibición aumenta el rango de proporciones viables de concentración de GAP/Cdc42 y, por lo tanto, aumenta la robustez contra las variaciones del número de copias de proteínas (cf. Fig. 2). Sin embargo, no cambia cualitativamente el mecanismo subyacente. (Derecha) La fusión de dominio de un dominio de unión a Cdc42-GTP con el precursor Bem1 de unión a Cdc24 conduce a una nueva conexión en la red de interacción de Cdc42 que conduce al reclutamiento de Cdc24 en la zona polar. A nivel de submódulos, esta nueva conexión constituye un nuevo submódulo funcional que llamamos “activación polar” (triángulo amarillo). Junto con el transporte de Cdc42 hacia la zona polar, la activación polar da lugar al mecanismo de reclutamiento mutuo altamente robusto que es operativo en la levadura WT (régimen de operación sombreado en verde en el plano de parámetros (ND, NG); cf. Fig. 4c). Tenga en cuenta que la escala en el eje vertical se elige más grande para enfatizar el régimen de operación significativamente mayor del mecanismo mediado por Bem1.

Hay varias rutas posibles para probar nuestras hipótesis. Una posibilidad es la construcción de árboles filogenéticos para las diferentes proteínas (dominios) que podrían informar sobre el orden en que aparecieron durante la evolución de la red de polaridad67. Otra posibilidad es buscar especies en el árbol de la vida actual que contengan pasos intermedios de la trayectoria evolutiva. Por ejemplo, especies con una versión más antigua de Bem1 que carece del dominio SH3 e identifican los principios de autoorganización de las proteínas que subyacen a la polarización en estas especies. Esta se está convirtiendo en una opción cada vez más realista, dado el gran número (y aún en expansión) de especies de hongos que se han secuenciado2 y el creciente interés de los biólogos celulares y moleculares por trabajar con sistemas que no son modelo68.

Desde una perspectiva más amplia, hemos demostrado cómo la comprensión de los principios mecanicistas que subyacen a la autoorganización puede proporcionar información sobre la evolución de las funciones celulares, un tema central en la biología celular evolutiva. Específicamente, hemos presentado un ejemplo concreto que muestra cómo un sistema autoorganizado podría haber evolucionado desde un mecanismo más rudimentario y genérico, sensible a parámetros, a un mecanismo específico, robusto y estrechamente controlado mediante sólo cambios incrementales69.

El objetivo principal del modelo matemático que proponemos es explicar el rescate de células bem1Δ por la pérdida de BEM3. Con ese fin, realizamos extensiones mínimas, pero esenciales, a un modelo previamente establecido12 que explica el mecanismo central de polarización de Cdc42 que depende de la vía mediada por Bem18,14,18,41,43. Es importante destacar que el modelo ampliado que proponemos aquí nos permite explicar varios hallazgos experimentales previos que hasta ahora seguían siendo desconcertantes. Resumiremos y discutiremos estos hallazgos que sirven como apoyo adicional para nuestro modelo en la discusión complementaria (Nota complementaria 5). A continuación, describimos los procesos biofísicos y bioquímicos (difusión, transporte basado en vesículas e interacciones de proteínas) explicados por nuestro modelo. La formulación matemática del modelo en el marco de sistemas de reacción-difusión acoplados en superficie masiva se presenta en la sección siguiente. El análisis de estabilidad lineal, el muestreo de parámetros y las simulaciones numéricas se describen en las Notas complementarias 2 a 4.

La célula se modela como un dominio esférico con una masa de difusión (citosol) en el interior y la membrana en la superficie donde las proteínas interactúan y se difunden lateralmente (consulte la figura complementaria 1). La dinámica de masa y de superficie está acoplada debido a la unión de la membrana y el desprendimiento de proteínas. Matemáticamente, el modelo está formulado como un sistema de reacción-difusión con acoplamiento masa-superficie. Como argumentaremos a continuación, ambas vías de transporte (ciclo citosólico y transporte basado en vesículas (Fig. 1b, c en el texto principal)) pueden incorporarse en este marco de modelado.

En trabajos anteriores, el tráfico de vesículas a lo largo de los cables de actina se modeló con diversos grados de detalle y se basó en diferentes suposiciones9,11,29,30,70,71,72. Sin embargo, por el momento no es factible elaborar un modelo mecanísticamente detallado del tráfico de vesículas porque la vía altamente compleja de reciclaje de vesículas (que implica endocitosis, transporte a lo largo de cables de actina, procesamiento en compartimentos de la membrana intracelular como los endosomas y el aparato de Golgi y, finalmente, exocitosis) no está completamente desarrollada. caracterizado experimentalmente. Sin embargo, como veremos, no se requiere una descripción detallada para el propósito del análisis aquí. En cambio, modelamos el reciclaje de vesículas de Cdc42 como un reclutamiento de membrana efectivo de Cdc42-GDP por Cdc42-GTP. Esta descripción eficaz incorpora las dos características esenciales del reciclaje de vesículas que son relevantes para la maquinaria de polarización: (i) el transporte de vesículas se dirige hacia el Cdc42-GTP unido a la membrana y (ii) el Cdc42 entregado a la membrana por las vesículas tras la exocitosis es (principalmente) Con destino al PIB71. Los detalles se analizan en la Nota complementaria 1.

Además del reciclaje de vesículas, se ha sugerido que varios efectores posteriores de Cdc42-GTP (Cla4, Gic1/Gic2 y flippasa31,32,48,73,74) facilitan el reclutamiento de membrana de Cdc42-GDP (consulte la Nota complementaria 1 para obtener más detalles). ). Incorporamos estas supuestas vías de reclutamiento de Cdc42-GDP junto con el transporte de Cdc42 basado en vesículas mediante un proceso de reclutamiento único y efectivo que está dirigido por Cdc42-GTP unido a membrana (ilustrado en la Fig. 1d (4) en el texto principal).

La Figura 1D muestra la red de interacción bioquímica subyacente a nuestro modelo. En esencia, se encuentra el ciclo GTPasa de Cdc42 ((1) en la figura 1d). Cdc42 circula entre un estado activo, unido a GTP, y uno inactivo, unido a GDP en la membrana. En su forma unida a GDP, Cdc42 puede unirse al inhibidor de la disociación de nucleótidos de guanina (GDI) Rdi1, que secuestra el anclaje de unión a la membrana de Cdc42 y, por lo tanto, le permite difundirse libremente en el citosol. El ciclo de Cdc42 entre sus estados unidos a GTP y GDP está regulado por el factor de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) Cdc24 y las proteínas activadoras de GTPasa (GAP) que catalizan la hidrólisis de GDP a GTP. En las células de tipo salvaje, Cdc42-GTP recluta la proteína de andamio Bem1 en la membrana, que a su vez recluta el GEF Cdc24 ((2) en la Fig. 1d) para formar un complejo Bem1-GEF. Estos complejos Bem1-GEF unidos a la membrana reclutan Cdc42-GDP desde el citosol a la membrana y lo activan allí ((3) en la Fig. 1d), cerrando así el circuito de retroalimentación (reclutamiento mutuo) que subyace a la polaridad WT8,10,15; ver referencias. 14 y 52 para revisiones recientes a través de la lente experimental y teórica, respectivamente. Este circuito de retroalimentación es capturado por el modelo introducido en la ref. 12. Hacemos las siguientes extensiones clave:

Modelado explícito de la hidrólisis de Cdc42 por GAP como reacción catalítica con un complejo intermedio Cdc42-GAP25.

Reclutamiento de membrana efectivo por Cdc42-GTP unido a membrana, que representa el transporte de Cdc42 basado en vesículas hacia zonas de alta concentración de Cdc42-GTP, así como otras posibles vías de reclutamiento mediadas por efectores posteriores de Cdc42-GTP21,31,32,33.

Unión a membrana de GEF Cdc24 independientemente de Bem1 a través del dominio PH75 de Cdc24.

El análisis del modelo en términos de subunidades funcionales muestra que se requieren las tres extensiones para describir el rescate de mutantes bem1Δ en el modelo. En la Nota complementaria 1 se analizan más detalles de estas extensiones de modelo, la motivación biológica y los supuestos subyacentes.

Dado que las células de levadura en ciernes son (casi) esféricas, estudiamos la dinámica de reacción-difusión de las proteínas en una geometría esférica compuesta por un citosol (masa) de radio R con membrana en su superficie (Figura complementaria S1). Naturalmente, elegimos coordenadas esféricas \(\left(r,\varphi,\theta \right)\). Para una notación general y compacta, denotamos las concentraciones de componentes citosólicos y unidos a la membrana mediante los vectores \(m\) y \(c\), respectivamente.

En general, consideramos dinámicas puramente difusivas,

con la matriz de constantes de difusión \({D}_{c}={{{\mathrm{diag}}}}\left(\{{D}_{i}\}\right)\). A menos que se indique lo contrario, todas las constantes de difusión citosólica se establecen en el mismo valor \({D}_{c}\) tal que \({D}_{c}={D}_{c}\).

En coordenadas esféricas, el laplaciano \({\nabla }^{2}\) que actúa sobre alguna función \(\psi\) dice

donde el laplaciano “angular” en la superficie de la esfera \(S\) está dado por

La masa se acopla a la membrana mediante reacciones de unión-desprendimiento que conducen a flujos de masa, \(f\), normales a la superficie.

donde \(n\) es el vector normal hacia adentro de la superficie. En coordenadas esféricas, el gradiente radial viene dado por la derivada radial \(n\cdot \nabla=-{\partial }_{r}\). Los flujos de apego-desapego \(f\) de nuestro modelo específico se especificarán más adelante.

La dinámica de los componentes unidos a membranas está dada por

donde la función no lineal \(g\) codifica las reacciones no lineales en la membrana. Tenga en cuenta que el operador de difusión en la membrana \({\nabla }_{m}^{2}={{\nabla }_{S}^{2}|}_{r=R}\) coincide con el volumen Laplaciano \({\nabla }^{2}\) restringido a la membrana en \(r=R\). Esto se debe a que la esfera cumple las simetrías rotacionales del operador de difusión.

Como abreviaturas para las concentraciones de proteínas utilizamos la misma notación abreviada que en la Fig. 1 del artículo: D – Cdc42-GDP; T – Cdc42-GTP; G – BPA; B – Bem1; F – FMAM. (Tenga en cuenta que nos referimos a Cdc24 como GEF para evitar confusión con Cdc42.) Denotamos las concentraciones de especies unidas a membrana con el símbolo \(m\) con subíndices en minúsculas, y las concentraciones citosólicas usando el símbolo \(c\) con subíndices en mayúsculas. (ver Tabla 1). Usando la notación vectorial introducida anteriormente, tenemos \(c=\left({c}_{D},{c}_{B},{c}_{F}\right),m=\left({m }_{d},{m}_{t},{m}_{{tg}},{m}_{g},{m}_{b},{m}_{{bf}}, {m}_{f}\derecha)\).

Las interacciones de proteínas descritas en la sección de resultados e ilustradas en la Fig. 1 se modelan mediante la cinética de la ley de acción de masas, con las velocidades de reacción descritas en la Tabla complementaria S1. La cinética de reacción lee

Y

En la Nota complementaria 1 se proporciona una discusión más detallada de los supuestos y la motivación de los términos específicos. La dinámica de reacción-difusión anterior conserva el número total de moléculas Cdc42, GAP, Bem1 y GEF.

Por tanto, estos números de copias de proteínas son parámetros de control del modelo.

Analizamos las ecuaciones de reacción-difusión anteriores utilizando análisis de estabilidad lineal y simulaciones numéricas. Los detalles se proporcionan en las Notas complementarias 2 a 4. En resumen, el análisis de estabilidad lineal produce las tasas de crecimiento de las perturbaciones del estado estacionario homogéneo. A partir de la relación de dispersión resultante (ilustrada en la figura complementaria S2), se puede leer si existe una inestabilidad que rompe la simetría y qué modo propio (modo armónico esférico en el caso de una celda esférica) crece más rápido. Existen estimaciones experimentales solo para algunos de los parámetros (consulte la Tabla complementaria S2). Por lo tanto, utilizamos el análisis de estabilidad lineal (que se puede realizar rápidamente en una computadora) para muestrear una gran cantidad de conjuntos de parámetros (5 × 106) e identificar aquellos que son compatibles con las observaciones experimentales (resumidos en la Tabla complementaria S3). Los conjuntos de parámetros resultantes abarcan múltiples órdenes de magnitud en cada eje de parámetros (consulte la Figura complementaria S3 y la Figura complementaria S4), lo que indica que el modelo es descuidado76,77. De estos conjuntos de parámetros, elegimos uno representativo (el más cercano a la media de los parámetros logarítmicos, consulte la Tabla complementaria S4) para generar los diagramas de estabilidad que se muestran en las Figs. 2, 4 y 5. Para ilustrar la polarización espontánea de un estado estacionario homogéneo ligeramente perturbado, así como la polarización inducida por un estímulo local, realizamos simulaciones numéricas utilizando COMSOL Multiphysics 5.4 (ver Películas complementarias 1 a 6).

Todos los medios utilizados tienen la misma base con 0,69 % p/v de base nitrogenada de levadura (Sigma) + 0,32 % de mezcla de aminoácidos (4 × CSM) (Formedium) + 2 % de rafinosa (Sigma). Utilizamos diferentes concentraciones de galactosa, denominadas x-Gal, donde x denota el porcentaje p/v de galactosa en el medio.

En la Tabla 2 se ofrece una descripción general de todas las cepas de levadura utilizadas en este trabajo. Las cepas haploides yWKD065, yWKD069, YWKD070, yWKD071 y yWKD073 se originaron a partir de la esporulación de diploides yWKD054 y YWKD055, utilizando la auxotrofia de histidina elevada para haploides de tipo a. Los diploides yWKD054 y yWKD055 se generaron mediante la integración de los plásmidos pWKD010 y pWKD011 en yLL1123 respectivamente. Los plásmidos pWKD010 y pWKD011 constan de un esqueleto pRL36878, con un marcador seleccionable URA3. Después de amplificar esta columna vertebral sin GFP, se agregaron regiones de homología aguas arriba y aguas abajo de CDC42 endógeno con ensamblaje de Gibson, separadas por un sitio de corte EcoRI. Después de cortar estos plásmidos con EcoRI (New England Biolabs), los flancos de homología aseguraron la integración genómica durante la transformación reemplazando a Cdc42 en su locus endógeno. Además, se añadió una supercarpeta GFP (sfGFP,79, secuencia de aminoácidos GenBank: QLY89013.1) en pWKD011 con ensamblaje de Gibson entre las posiciones L134 y R135 de CDC42. Esto se basa en trabajos anteriores sobre S. cerevisiae, donde se integró un mCherry dentro de Cdc4213. Eliminamos los efectos de aptitud física de mcherry-Cdc42SW mediante el uso de una proteína GFP supercarpeta, como lo sugiere el trabajo en S. pombe (Bendezú et al., 2015). Los plásmidos y las integraciones genómicas se verificaron mediante secuenciación.

Los ensayos presentados en la Fig. 3 no requirieron sfGFP, ya que los experimentos de localización planificados utilizando microscopía de fluorescencia sufrieron una degradación incompleta de sfGFP como se documentó anteriormente en la literatura80. Probamos si los resultados presentados, como las diferencias en la tasa de crecimiento entre los niveles de galactosa, no son un artefacto de la adición de este fluoróforo, o diferencias de auxotrofia entre cepas. Confirmamos que la presencia de la inserción de sfGFP no afectó significativamente la tasa de crecimiento de las células con CDC42 bajo el promotor Gal para diversas condiciones de galactosa (consulte la figura complementaria S5 y las tablas complementarias S6 y S7). Además, el medio se complementó con concentraciones de aminoácidos cuatro veces superiores a las normales para abordar las diferencias en las auxotrofias entre yLL3a y las otras cepas, y no se observó ninguna diferencia en las tasas de crecimiento máximas de YWKD065a e yLL3a en la Fig. 3.

Utilizamos un lector de placas (Infinite M-200 pro, Tecan) para los ensayos de tasa de crecimiento, con placas de 96 pocillos de Thermo Scientific, Nunc edge 2 96 F CL, tapa SI no tratada, CAT.NO.: 267427. Filas A y H y las columnas 1 y 12 no se utilizaron para las mediciones. Inoculamos una placa de 96 pocillos con 100 µl de medio y 5 µl de células (de reservas de glicerol) en cada pocillo y cultivamos las células en una placa de 96 pocillos durante 48 h a 30 °C en una habitación cálida. Posteriormente, las células se diluyeron 200 × en una nueva placa de 96 pocillos, que luego se colocaron en el lector de placas y se midió la DO600 durante 48 h utilizando una combinación de agitación lineal y orbital a 36 °C. Utilizamos un programa de análisis de datos escrito en casa en Matlab81 para determinar el tiempo de duplicación de la fase logarítmica para cada pozo. El tiempo de duplicación se aproximó ajustando la pendiente del régimen lineal del diagrama logarítmico de los datos brutos. Realizamos al menos dos experimentos diferentes por condición y realizamos al menos 4 réplicas técnicas por combinación de cepa y condición (excepto con 2% de galactosa); consulte la Tabla complementaria S5.

Los posteriores de fondos no WT siguieron desde la normalización a las tasas de WT mediante simulaciones de Monte Carlo del cociente de los posteriores de tasa de crecimiento originales no normalizados en un fondo genético y el posterior WT en ese medio. Los posteriores no normalizados se calcularon utilizando el algoritmo de Metropolis-Hastings82, a partir de funciones anteriores rectangulares y de probabilidad t de Student de duplicar las estimaciones de ajuste temporal de todas las réplicas en ese medio. Los errores estándar de las estimaciones individuales provienen del error estándar del parámetro de pendiente resultante de los mínimos cuadrados ponderados (WLS) en una ventana móvil por curva OD, utilizando un proxy de error instrumental para las ponderaciones WLS. Los errores estándar de las estimaciones individuales se corrigen por sobredispersión mediante el índice de Birge modificado83 promedio en todos los medios para WT.

Las imágenes de microscopía se tomaron con un microscopio invertido Nikon Eclipse Ti-E con objetivo de inmersión en aceite 60×, con NA 1,40 y factor de zoom 1,5. Utilizamos 96 placas multipocillos negras que cumplen con el formato estándar SBS (Society for Biomolecular Screening) con fondos de cubreobjetos hechos de vidrio de borosilicato.

Las células se incubaron utilizando la primera parte del protocolo de ensayo de tasa de crecimiento (en el lector de placas a 30 °C durante 48 h). Luego, se diluyeron 100X en una placa nueva y se incubaron a 36 °C durante 24 h, antes de alcanzar la saturación completa. Las células se diluyeron 1000x para los fondos WT para todas las concentraciones de galactosa y 100x para los fondos no WT para concentraciones de galactosa superiores al 0,05%.

El medio utilizado para incubar y diluir las células fue 4xCSM + 2% Rafinosa con las respectivas concentraciones de galactosa, para cada cepa.

Todas las imágenes de microscopía se tomaron con un microscopio invertido Olympus IX81 equipado con módulos Andor Revolution y Yokogawa CSU X1. Usamos un objetivo de aceite de 100 ×. El software de adquisición instalado es Andor iQ3. Las placas de imágenes CG eran de Zell-Kontakt. Son placas multipocillos negras que cumplen con el formato estándar SBS (Society for Biomolecular Screening) con fondos de cubreobjetos hechos de vidrio de borosilicato.

Las células se cultivaron durante la noche en medio CSM + 2% rafinosa + 2% galactosa, sin alcanzar la saturación. Al día siguiente, se realizaron tres pasos de lavado con CSM+ Rafinosa al 2% y posteriormente las células se resuspendieron en los medios deseados de Galactosa al 0%, 0,06% y 0,1%. Para obtener poblaciones celulares en todas las concentraciones de galactosa, primero incubamos todas las cepas en una concentración de galactosa del 2%, donde Cdc42 está altamente sobreexpresado, de modo que también las células bem1Δ pueden polarizarse de manera eficiente. Después de 15 h de incubación en una concentración de galactosa al 2%, cambiamos el medio a la concentración de galactosa deseada. Después de 24 h, observamos las células con microscopía óptica. Después de 24 h, el Cdc42 sobrante de la incubación inicial con una concentración de galactosa del 2% es muy bajo debido a la degradación y la dilución (la vida media de Cdc42 es de aproximadamente 8 h84). A partir de estas imágenes, determinamos el radio celular promedio de las células de la población.

Tenga en cuenta que todos contienen el mismo medio base: CSM+ 2% Rafinosa. Posteriormente, las células se incubaron durante 8 h a 30 °C seguido de una sesión de imágenes y posteriormente se incubaron durante otras 16 h, después de lo cual se realizaron otras sesiones de imágenes. Realizamos tres experimentos independientes para cada concentración de galactosa.

Realizamos ensayos de microscopía de campo brillante para controlar el tamaño de las células en diferentes niveles de Cdc42 en diferentes orígenes genéticos. Con ImageJ determinamos manualmente el perímetro de las células individuales ajustando las células vivas a un círculo con la herramienta Medir. Realizamos tres experimentos independientes por condición y por cepa. Además, comprobamos visualmente cuántas células estaban vivas y cuántas muertas en función de su morfología. Observamos lo que se denomina muerte celular accidental85 al inducir un número de copias de la proteína Cdc42 muy bajo regulado por el promotor Gal. Este tipo de muerte celular muestra un fenotipo muy distintivo asociado a la necrosis, a saber: desintegración de la estructura celular y ruptura de la membrana plasmática (ver Figura complementaria S7). Una vez que observamos este fenotipo en nuestras células, las clasificamos como muertas. La barra de error de la fracción de células muertas, así como del radio celular promedio, se calcula como el error estándar sobre el número total de células analizadas.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos experimentales generados en este estudio han sido depositados en los repositorios de 4TU: microscopía cruda [https://doi.org/10.4121/60bea990-b1a6-40c7-9355-584e061791d5.v2] y tasas de crecimiento [https://doi. org/10.4121/67e56fe8-6b54-446b-aaac-cd2e245ee066.v1]. Los conjuntos de parámetros para el modelo matemático están disponibles en GitHub [https://github.com/f-brauns/yeast-polarity-LSA]. Los datos originales se proporcionan con este documento.

El código de Mathematica para el análisis de estabilidad lineal del modelo matemático y los archivos de simulación COMSOL Multiphysics se proporcionan en GitHub [https://github.com/f-brauns/yeast-polarity-LSA]. Este repositorio también contiene conjuntos de parámetros filtrados a partir de muestreos espaciales de parámetros a gran escala. Los scripts de Matlab y Python utilizados para analizar datos experimentales se proporcionan en el siguiente repositorio de Github [https://github.com/leilaicruz/Experimental-data-analysis-protein-copy-number-in-polarity].

Glazenburg, MM & Laan, L. Complejidad y autoorganización en la evolución de la polarización celular. J. Ciencia celular. 136, jcs259639 (2023).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Diepeveen, ET, Gehrmann, T., Pourquié, V., Abeel, T. & Laan, L. Patrones de conservación y diversificación en la red de polarización de hongos. Genoma Biol. Evolución. 10, 1765-1782 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Laan, L., Koschwanez, JH y Murray, AW La adaptación evolutiva después de una polarización celular paralizante sigue trayectorias reproducibles. eLife 4, e09638 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Kang, PJ Un factor de intercambio PIB/GTP implicado en la vinculación de un punto de referencia espacial con la polaridad celular. Ciencia 292, 1376-1378 (2001).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Marston, AL, Chen, T., Yang, MC, Belhumeur, P. y Chant, J. Un factor de intercambio de GTPasa localizado, Bud5, determina la orientación de los ejes de división en la levadura. actual. Biol. 11, 803–807 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kozminski, KG y cols. La interacción entre una GTPasa Ras y Rho acopla la selección de un sitio de crecimiento con el desarrollo de la polaridad celular en la levadura. Mol. Biol. Celda 14, 4958–4970 (2003).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bi, E. y Park, H.-O. Polarización celular y citocinesis en levaduras en ciernes. Genética 191, 347–387 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Irazoqui, JE, Gladfelter, AS y Lew, DJ Rotura de simetría mediada por andamio por Cdc42p. Nat. Biol celular. 5, 1062-1070 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wedlich-Soldner, R. Polarización celular espontánea mediante la administración de la GTPasa Cdc42 basada en actomiosina. Ciencia 299, 1231-1235 (2003).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Goryachev, AB & Pokhilko, AV Dynamics of Cdc42 network incorpora un mecanismo de polaridad de células de levadura tipo Turing. FEBS Lett. 582, 1437-1443 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Freisinger, T. y col. Establecimiento de un eje único robusto de polaridad celular mediante el acoplamiento de múltiples bucles de retroalimentación positiva. Nat. Comunitario. 4, 1807 (2013).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Klünder, B., Freisinger, T., Wedlich-Söldner, R. & Frey, E. La polarización celular mediada por GDI en levadura proporciona un control espacial y temporal preciso de la señalización de Cdc42. Computación más. Biol. 9, e1003396 (2013).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Woods, B., Kuo, C.-C., Wu, C.-F., Zyla, TR y Lew, DJ El establecimiento de la polaridad requiere la activación localizada de Cdc42. J. Biol celular. 211, 19-26 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chiou, J., Balasubramanian, MK y Lew, DJ Polaridad celular en levadura. Año. Rev. Desarrollo celular. Biol. 33, 77-101 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bosé, I. et al. Ensamblaje de complejos mediados por andamios que contienen Cdc42p, el factor de intercambio Cdc24p y el efector Cla4p necesarios para la fosforilación de Cdc24p regulada por el ciclo celular. J. Biol. Química. 276, 7176–7186 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Butty, A.-C. Un circuito de retroalimentación positiva estabiliza el factor de intercambio de guanina-nucleótido Cdc24 en los sitios de polarización. EMBO J. 21, 1565-1576 (2002).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Howell, AS y cols. Singularidad en la polarización: recableado de células de levadura para formar dos cogollos. Celda 139, 731–743 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kozubowski, L. et al. Polarización que rompe la simetría impulsada por un complejo Cdc42p GEF-PAK. actual. Biol. 18, 1719-1726 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chenevert, J., Corrado, K., Bender, A., Pringle, J. & Herskowitz, I. Un gen de levadura (BEM1) necesario para la polarización celular cuyo producto contiene dos dominios SH3. Naturaleza 356, 77–79 (1992).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Smith, SE y cols. Independencia de la ruptura de simetría en la activación autocatalítica de Cdc42 mediada por Bem1. J. Biol celular. 202, 1091-1106 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Grinhagens, S. y col. Un análisis de interacción de Bem1 resuelto en el tiempo reconstruye el flujo de Cdc42 durante el crecimiento polar. Ciencias de la vida. Alianza 3, e202000813 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Shimada, Y., Wiget, P., Gulli, M.-P., Bi, E. y Peter, M. El factor de intercambio de nucleótidos Cdc24p puede regularse mediante autoinhibición. EDUCACIÓN J. 23, 1051–1062 (2004).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rapali, P. et al. Activación mediada por andamio del flujo de señalización de Cdc42. eLife 6, e25257 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Magadum, S., Banerjee, U., Murugan, P., Gangapur, D. y Ravikesavan, R. La duplicación de genes como fuerza importante en la evolución. J. Genet. 92, 155-161 (2013).

Artículo PubMed Google Scholar

Zhang, B., Wang, Z.-X. & Zheng, Y. Caracterización de las interacciones entre la pequeña GTPasa Cdc42 y sus proteínas activadoras de GTPasa y supuestos efectores. J. Biol. Química. 272, 21999–22007 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Khalili, B., Merlini, L., Vincenzetti, V., Martin, SG y Vavylonis, D. Exploración y estabilización de la zona de apareamiento Ras1: un mecanismo con retroalimentación positiva y negativa. Computación más. Biol. 14, e1006317 (2018).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Okada, S. y col. La identidad de las células hijas surge de la interacción de Cdc42, septinas y exocitosis. Desarrollo. Celda 26, 148-161 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Howell, AS y cols. La retroalimentación negativa mejora la robustez en el circuito de establecimiento de polaridad de la levadura. Celda 149, 322–333 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Slaughter, BD, Das, A., Schwartz, JW, Rubinstein, B. & Li, R. Los modos duales de reciclaje de Cdc42 afinan la morfogénesis polarizada. Desarrollo. Celda 17, 823–835 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Layton, AT y cols. El modelado del tráfico de vesículas revela consecuencias inesperadas para el establecimiento de polaridad mediado por Cdc42p. actual. Biol. 21, 184-194 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tiedje, C., Sakwa, I., Just, U. y Höfken, T. Rho GDI Rdi1 regula las Rho GTPasas mediante distintos mecanismos. Mol. Biol. Celda 19, 2885–2896 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Das, A. et al. La asimetría de fosfolípidos mediada por flippasa promueve el reciclaje rápido de Cdc42 en el mantenimiento dinámico de la polaridad celular. Nat. Biol celular. 14, 304–310 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Daniels, CN, Zyla, TR y Lew, DJ Un papel de Gic1 y Gic2 en la polarización de Cdc42 a temperatura elevada. Más uno 13, e0200863 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Goryachev, AB y Leda, M. Muchos caminos hacia la ruptura de la simetría: mecanismos moleculares y modelos teóricos de la polaridad de las células de levadura. Mol. Biol. Celda 28, 370–380 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kulak, NA, Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N. y Mann, M. Procesamiento mínimo de muestras proteómicas encapsuladas aplicado a la estimación del número de copias en células eucariotas. Nat. Métodos 11, 319–324 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Chong, YT y cols. Dinámica del proteoma de levadura a partir de imágenes unicelulares y análisis automatizado. Celda 161, 1413-1424 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yocum, RR, Hanley, S., West, R. y Ptashne, M. Uso de fusiones lacZ para delimitar elementos reguladores del promotor GAL1-GAL10 divergente inducible en Saccharomyces cerevisiae. Mol. Celúla. Biol. 4, 1985–1998 (1984).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Lu, MS y Drubin, DG Cdc42 GTPase regula los ESCRT en el sellado de la envoltura nuclear y la remodelación del ER. J. Biol celular. 219, e201910119 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kass, RE y Raftery, AE Factores de Bayes. Mermelada. Estadística. Asociación. 90, 773–795 (1995).

Artículo MathSciNet MATEMÁTICAS Google Scholar

Allard, CAH, Decker, F., Weiner, OD, Toettcher, JE y Graziano, BR Un temporizador de duración de las yemas que no varía en el tamaño permite un control sólido del tamaño de las células de la levadura. Más uno 13, e0209301 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Bendezú, FO et al. Polarización espontánea de Cdc42 independiente de la extracción mediada por GDI y el tráfico basado en actina. Más Biol. 13, e1002097 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Woods, B. y col. Las vías de reciclaje paralelas independientes de actina polarizan Cdc42 en la levadura en ciernes. actual. Biol. 26, 2114-2126 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Witte, K., Strickland, D. y Glotzer, M. La entrada al ciclo celular desencadena un cambio entre dos modos de activación de Cdc42 durante la polarización de la levadura. eLife 6, e26722 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Kang, PJ, Miller, KE, Guegueniat, J., Beven, L. y Park, H.-O. El papel compartido de la GTPasa Rsr1 y Gic1/Gic2 en la polarización de Cdc42. Mol. Biol. Celda 29, 2359–2369 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Altschuler, SJ, Angenent, SB, Wang, Y. & Wu, LF Sobre la aparición espontánea de la polaridad celular. Naturaleza 454, 886–889 (2008).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kuo, C.-C. et al. La fosforilación inhibidora del GEF proporciona retroalimentación negativa en el circuito de polaridad de la levadura. actual. Biol. 24, 753–759 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mukherjee, D. y col. Bem3, una proteína activadora de GTPasa Cdc42, circula a un compartimento intracelular y recluta la Rab GTPasa Sec4 secretora a las endomembranas. J. Ciencia celular. 126, 4560–4571 (2013).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Brown, JL, Jaquenoud, M., Gulli, M.-P., Chant, J. y Peter, M. Las nuevas proteínas de unión a Cdc42 Gic1 y Gic2 controlan la polaridad celular en levadura. Desarrollo de genes. 11, 2972–2982 (1997).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Daalman, WK-G., Sweep, E. & Laan, L. Un modelo ascendente manejable del mapa genotipo-fenotipo de polaridad de levadura para predicciones evolutivas relevantes. bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.11.09.374363 (2020).

Huang, KC, Meir, Y. y Wingreen, NS Estructuras dinámicas en Escherichia coli: formación espontánea de anillos MinE y zonas polares MinD. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. 100, 12724–12728 (2003).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Halatek, J. & Frey, E. La transferencia MinD altamente canalizada y el secuestro de MinE explican el origen de la dinámica robusta de la proteína MinCDE. Representante celular 1, 741–752 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Halatek, J., Brauns, F. y Frey, E. Principios de autoorganización de la formación de patrones intracelulares. Filos. Trans. R. Soc. B Biol. Ciencia. 373, 20170107 (2018).

Artículo de Google Scholar

Glock, P. y col. Patrones estacionarios en un sistema de reacción-difusión de dos proteínas. Sintetizador ACS. Biol. 8, 148-157 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ozbudak, EM, Becskei, A. y van Oudenaarden, A. Un sistema de contrarresto de bucles de retroalimentación regula la actividad de Cdc42p durante la polarización celular espontánea. Desarrollo. Celda 9, 565–571 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lynch, M. y col. Biología celular evolutiva: dos orígenes, un objetivo. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. 111, 16990–16994 (2014).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Papp, B., Pál, C. & Hurst, LD Sensibilidad a la dosis y evolución de familias de genes en levadura. Naturaleza 424, 194-197 (2003).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Wittkopp, PJ y Kalay, G. Elementos reguladores cis: mecanismos moleculares y procesos evolutivos subyacentes a la divergencia. Nat. Rev. Genet. 13, 59–69 (2012).

Artículo CAS Google Scholar

Conant, GC y Wolfe, KH Convertir un pasatiempo en un trabajo: cómo los genes duplicados encuentran nuevas funciones. Nat. Rev. Genet. 9, 938–950 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Stevenson, BJ y cols. La mutación de RGA1, que codifica una supuesta proteína activadora de GTPasa para la proteína de establecimiento de polaridad Cdc42p, activa la vía de respuesta a feromonas en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Desarrollo de genes. 9, 2949–2963 (1995).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Tong, Z. y col. Posicionamiento adyacente de estructuras celulares permitido por una zona de inhibición mediada por la proteína activadora de Cdc42 GTPasa. J. Biol celular. 179, 1375-1384 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Knaus, M. y col. La fosforilación de Bem2p y Bem3p puede contribuir a la activación local de Cdc42p en la aparición de las yemas. EMBO J. 26, 4501–4513 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Daalman, W., Sweep, E. y Laan, L. El camino hacia la predicción de la evolución como se ilustra en la polaridad de las células de levadura. Celdas 9, 2534 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Good, MC, Zalatan, JG & Lim, WA Proteínas de andamio: centros para controlar el flujo de información celular. Ciencia 332, 680–686 (2011).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Farr, AD, Remigi, P. y Rainey, PB Evolución adaptativa mediante fusión espontánea de dominios y relocalización de proteínas. Nat. Ecológico. Evolución. 1, 1562-1568 (2017).

Artículo PubMed Google Scholar

Lamas, I., Merlini, L., Vještica, A., Vincenzetti, V. y Martin, SG Optogenetics revela la activación local de Cdc42 mediante retroalimentación positiva mediada por andamio y Ras GTPasa. bioRxiv https://doi.org/10.1101/710855 (2019).

Martin, SG y Arkowitz, RA Polarización celular en levaduras en gemación y fisión. Microbiol FEMS. Rev. 38, 228–253 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hooff, JJE, Tromer, E., Dam, TJP, Kops, GJPL y Snel, B. Inferir la historia evolutiva de su proteína favorita: una guía para biólogos moleculares. BioEssays 41, 1900006 (2019).

Artículo de Google Scholar

Russell, JJ y cols. Organismos modelo no modelo. BMC Biol. 15, 55 (2017).

Johnson, BR & Lam, SK Autoorganización, selección natural y evolución: hardware celular y software genético. Biociencia 60, 879–885 (2010).

Artículo de Google Scholar

Hawkins, RJ, Bénichou, O., Piel, M. & Voituriez, R. Reconstrucción de carreteras del citoesqueleto: polarización de células inducida por transporte activo. Física. Rev. E 80, 040903 (2009).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Savage, NS, Layton, AT y Lew, DJ Modelo matemático mecanicista de polaridad en levadura. Mol. Biol. Celda 23, 1998-2013 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Müller, N. et al. Un modelo predictivo para la polarización de células de levadura en gradientes de feromonas. Computación más. Biol. 12, e1004795 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, G.-C., Kim, Y.-J. & Chan, CSM Las proteínas Gic1 y Gic2 asociadas a la GTPasa Cdc42 son necesarias para el crecimiento de células polarizadas en Saccharomyces cerevisiae. Desarrollo de genes. 11, 2958–2971 (1997).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, H. y col. Regulación Cdc42p de la forma de levadura Bni1p mediada por el efector Gic2p. Mol. Biol. Celda 23, 3814–3826 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rossman, KL, Der, CJ y Sondek, J. GEF significa ir: activar RHO GTPasas con factores de intercambio de nucleótidos de guanina. Nat. Rev. Mol. Biol celular. 6, 167–180 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Daniels, BC, Chen, Y.-J., Sethna, JP, Gutenkunst, RN y Myers, CR Descuido, robustez y capacidad de evolución en biología de sistemas. actual. Opinión. Biotecnología. 19, 389–395 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Gutenkunst, RN y cols. Sensibilidades de parámetros universalmente descuidadas en modelos de biología de sistemas. Computación PLoS. Biol. 3, e189 (2007).

Artículo ADS MathSciNet PubMed PubMed Central Google Scholar

Wedlich-Soldner, R., Wai, SC, Schmidt, T. & Li, R. La polaridad celular robusta es un estado dinámico establecido mediante el transporte de acoplamiento y la señalización de GTPasa. J. Biol celular. 166, 889–900 (2004).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pédelacq, J.-D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, TC & Waldo, GS Ingeniería y caracterización de una proteína fluorescente verde supercarpeta. Nat. Biotecnología. 24, 79–88 (2006).

Artículo PubMed Google Scholar

Khmelinskii, A. et al. Degradación proteasomal incompleta de proteínas fluorescentes verdes en el contexto de temporizadores de proteínas fluorescentes en tándem. Mol. Biol. Celda 27, 360–370 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Daalman, WK-G., Sweep, E. y Laan, L. Un modelo físico manejable para la polaridad de la levadura predice la epistasis y la aptitud. Filos. Trans. R. Soc. B Biol. Ciencia. 378, 20220044 (2023).

Artículo CAS Google Scholar

Hastings, WK Métodos de muestreo de Monte Carlo utilizando cadenas de Markov y sus aplicaciones. Biometrika 57, 97 (1970).

Artículo MathSciNet MATEMÁTICAS Google Scholar

Bodnar, O. & Elster, C. Sobre el ajuste de datos inconsistentes utilizando el índice de Birge. Metrología 51, 516–521 (2014).

ADS del artículo Google Scholar

Christiano, R., Nagaraj, N., Fröhlich, F. & Walther, TC Análisis de recambio global del proteoma de las levaduras S. cerevisiae y S. pombe. Representante celular. 9, 1959-1965 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Carmona-Gutiérrez, D. et al. Directrices y recomendaciones sobre la nomenclatura de muerte celular de levaduras. Microbio. Celda 5, 4–31 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Martin, SG Polarización celular espontánea: el control de retroalimentación de la Cdc42 GTPasa rompe la simetría celular. BioEssays 37, 1193-1201 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Descargar referencias

Agradecemos a Felix Meigel y Marit Smeets por su trabajo experimental pionero. Agradecemos a Eelco Tromer por sus consejos sobre filogenética. Agradecemos a Daniel Needleman y Andrew Goryachev por la lectura crítica del manuscrito. EF agradece el apoyo de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Fundación Alemana de Investigación) a través del Centro de Investigación Colaborativa 1032—ID de Proyecto 201269156—y el Clúster de Excelencia ORIGINS bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania—EXC-2094—390783311. LL y LIC reconocen el apoyo de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO) a través de una subvención VIDI (016.Vidi.171.060). LL y WD reconocen el apoyo de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO/OCW), como parte del Programa Gravitación: Fronteras de la Nanociencia. LL reconoce la financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención n.º 758132).

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Centro Arnold Sommerfeld de Física Teórica y Centro de Nanociencia, Departamento de Física, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Alemania

Fridtjof Brauns, Jacob Halatek y Erwin Frey

Instituto Kavli de Física Teórica, Universidad de California Santa Bárbara, Santa Bárbara, CA, 93106, EE. UU.

Fridtjof Braun

Departamento de Bionanociencia, Instituto Kavli de Nanociencia de Delft, Universidad Tecnológica de Delft, Delft, Países Bajos

Leila M. Íñigo de la Cruz, Werner K.-G. Daalman, Ilse de Bruin y Liedewij Laan

Escuela Max Planck Matter to Life, Hofgartenstraße 8, D-80539, Múnich, Alemania

Erwin Frey

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

Investigación diseñada por FB, LIC, WD, JH, LL y EF; FB, JH y EF diseñaron los modelos teóricos y realizaron los análisis matemáticos; LIC, WD e IB y LL diseñaron y llevaron a cabo los experimentos; FB, LIC, WD, LL y EF escribieron el artículo.

Correspondencia a Liedewij Laan o Erwin Frey.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Brauns, F., Iñigo de la Cruz, LM, Daalman, W.KG. et al. Redundancia y papel del número de copias de proteínas en la maquinaria de polarización celular de la levadura en ciernes. Nat Comuna 14, 6504 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-42100-0

Descargar cita

Recibido: 05 de febrero de 2022

Aceptado: 26 de septiembre de 2023

Publicado: 16 de octubre de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-42100-0

Cualquier persona con la que comparta el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.